Lees hier de samenvatting en de meest belangrijke oefenvragen van Basisprincipes van de PCR | 9789077423974

• 3 Wat is PCR

• Hoeveel basenparen lang is een PCR-product?

  Meestal ergens tussen de 70 en de 150 bp, maar er kan tot 40kb groot worden geamplificeerd. 

• Waarom loopt de toename van het PCR product exponentieel en niet lineair?

  In het begin zal er relatief weinig amplimeer gevormd worden en blijft de hoeveelheid DNA onder de detectie grens. Echter zal na een aantal cycli de hoeveelheid amplimeren sterk toenemen en tijdens de laatste fase zal het weer afzwakken omdat dan de reactiecomponenten in de PCR mix opraken. 

• 3.3 cDNA-synthese en de reverse transcriptase-PCR

  Dit is een preview. Er zijn 4 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 3.3
  Laat hier meer flashcards zien

• Hoe wordt er vanuit RNA, DNA gemaakt?

  1. Primer bindt aan een RNA
  2. Reverse transcriptase kan vervolgens een DNA streng synthetiseren waardoor er een RNA DNA hybride molecuul ontstaat.
  3. DNA streng is enkelstrengs cDNA en kan worden gebruikt voor de PCR reactie. 
  4. Hier wordt in de denaturatie fase het RNA van het DNA gescheiden waardoor er alleen een enkelstrengs cDNA overblijft
  5. Vervolgens zal de DNA polymerase binden aan dit cDNA en er een dubbel strengs DNA molecuul van maken. 

• Wanneer RNA een verstorende werking zou hebben op je experiment hoe kan je deze dan uit de reactie verwijderen?

  Dit kun je dan doen door een RNAseH-stap toe te voegen. Hier zorgt het Rnase enzym ervoor het het RNA uit het mengsel zal worden verwijderd. 

• Waarom hebben retrovirussen het enzym reverse transcriptase inzich?

  Dit komt doordat deze virussen RNA hebben als genetisch materiaal, wanneer zij een cel infecteren en zij hun genetisch materiaal willen inbouwen in het genoom van de gastheercel, zal het RNA van het virus eerst moeten worden omgezet in een DNA-kopie en dat kan een dierlijke cel niet. 

• Wat is een nadeel van reverse transcriptase enzymen?

  Dat deze relatief veel foute nucleotide toevoegen bij overschrijven van RNA naar DNA 1 fout op 17.000-30.000 bp. 

• Waarom is een AMV-transcriptase beter geschikt voor een RNA template met veel secundaire structuren?

  Dit komt omdat bij een hoger ereactie temperatuur de secundaire RNA structuur beter wordt gedenatureerd en deze in een open conformatie wordt gehouden. De AMV transcriptase heeft een optimale temperatuur ergens tussen de 42 en de 60 graden celcius. 

• Wat zijn de overeenkosmten en verschillen tussen de AMV en de M-MLV?

  De overeenkomsten zijn dat ze allebei mg2+ als cofactor hebben en een 3'-OH uiteinde van de primer nodig hebben om de cDNA te synthetiseren. De verschillen zijn echter dat AMV een optimale temp heeft tussen de 42 en de 60 graden en dat de M-MLV een optimale temp heeft tussen de 37 en de 42 graden

• Op welke manier kan er tijdens de PCR onderscheid gemaakt worden tussen genomisch DNA en cDNA?

  • Het gebruik maken van primers waarvan de sequentie in twee opeenvolgende exonen ligt. 
  • Primer te kiezen die net voor een exon-intron overgan plakken. De PCR produceten van het cDNA zullen dan korter zijn dan de genomische DNA PCR fragmenten. 

• 3.4 Multiplex PCR

  Dit is een preview. Er zijn 5 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 3.4
  Laat hier meer flashcards zien

• Wat is een multiplex PCR?

  Dit is een PCR-reactie waarin meerdere PCR-producten tegelij in het zelfde reactievaatje worden aangemaakt door meerdere primerparen aan een reactie toe te voegen.