Lees hier de samenvatting en de meest belangrijke oefenvragen van Moleculaire Cel biologie Jaar 2 Praktijk

• 1 Digestie

  Dit is een preview. Er zijn 6 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 1
  Laat hier meer flashcards zien

• Waarom is het belangrijk om de digestie reactie onder optimale condities uit de voeren?

  Dit is belangrijk omdat in sub-optimale condities er ser-activiteit kan ontstaan. Hierdoor kan de digestie niet volledig lopen en kunnen uiteindelijk ook de uiteinden niet goed aan elkaar worden geligeerd.

• Waarom mag je een restrictie enzym nooit op kamertemperatuur bewaren of langdurig op ijs?

  Wanneer dit wordt gedaan gaat de kwaliteit van het enzym achteruit of kan zelf gaan denatureren. Hierdoor kan hij het DNA niet meer knippen en krijg je dus niet de gewenste resultaten.

• Waarom mag je een enzym in een reactiebuffer niet invriezen?

  Enzym dat wordt ingevroren in een andere buffer dan de speciale bewaarbuffer wordt onwerkzaam.

• Waarom mag je de restrictie enzymen pas als laatste aan de digestie reactie toevoegen?

  1. Enzymen zijn duur, op het moment dat er wat verkeerd wordt gepipetteerd kun je ook het RE weggooien. 
     
  2. Je wilt het RE niet aan extreme condities blootstellen. De buffer heeft dan namelijk nog niet de omgeving optimaal gemaakt. 
  3. Je wilt niet dat het RE al van te voren gaat knippen terwijl het epje nog niet volledig compleet is. 

• Wat kan allemaal leiden tot partiële digestie (8)?

  • Te weinig/te veel restrictie enzym
    
  • Te veel substraat 
  • Te korte incubatie tijd 
  • Slechte kwaliteit van het restrictie enzym
  • Inaccurate pipetteren van de kleine volumes
  • Verkeerde buffer
  • Verkeerde temperatuur
  • DNA is gemethyleerd. 

• Hoe vul je een pipetteer schema in?

  1. Vul eerst in wat je allemaal weet: stockconcentraties en gewenste concentraties en wat je allemaal gaat pipetteren + eindvolume van de digestie. 
  2. Vervolgens volumes van DNA + buffers + restrictie enzymen
  3. Wat er nog aan volume over blijft is het water

• Hoe bepaal je hoeveel ug DNA je voor de digestie gaat gebruiken?

  Dit doe je door vooraf te bedenken hoeveel DNA je nodig gaat hebben voor de rest van de experimenten die je gaat uitvoeren.

• 1.1 Hitte inactivtatie

• Waarom moet je een restrictie-enzym deactiveren?

  Dit moet worden gedeactiveerd om te voorkomen dat het enzym blijft doorknippen. Dit kan er namelijk voor zorgen dat tijdens de ligatie het DNA wat je aan elkaar probeert te ligeren steeds weer uit elkaar wordt geligeerd.

• Hoe kun je een enzym deactiveren?

  Dit kan worden gedaan door hitte inactivatie. Waarbij het enzym na de incubatie van de digestie voor een bepaalde tijd bij hoge temperatuur (voorbeeld 20m bij 65 graden) wordt geincubeerd. Het enzym denatureert dan en wordt onwerkzaam.

• 1.2 Defosforylatie

  Dit is een preview. Er zijn 3 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 1.2
  Laat hier meer flashcards zien

• Waarom wordt een defosforylatie uitgevoerd op de vector en niet ook nog op het insert?

  Deze wordt uitgevoerd om te vector om te voorkomen dat deze weer dicht ligeert (zelfsluiter). Wanneer je dit op het insert en op de vector zou doen mist de volledige fosfaatgroep en kan deze nooit meer aan elkaar worden geligeerd.