Lees hier de samenvatting en de meest belangrijke oefenvragen van KMB college 4

• 1 KMB college 4

  Dit is een preview. Er zijn 4 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 1
  Laat hier meer flashcards zien

• Wat is confocale fluorescentie microscopie?

  Een opname van het object met verschillende focusdiepten (out-of-focus informatie uitgesloten). Lasterlicht straalt via een confocale pinhole op een dichroïsche spiegel, die weerkaast het ligt naar een lens die het licht concentreert op een specifiek punt in het monster. Het licht reflecteert terug door de lens en de spiegel, door een confocale pinhole op een detector.

• Wat zijn de toepassingen van confocale fluorescentie microscopie?

  • genactiviteit
    
  • dynamische lokalisatie van eiwitten
    
  • bij locatie-specifieke-labeling: kleurstoffen die naar een specifieke locatie in de cel gaan of gelabelde eiwitten die een specifieke localisatie in een organel hebben
  • bij niet-locatie-specifieke-labeling: 
  • lokale fotoactivatie
  • FRAP
  • FLIP

• Wat is lokale fotoactivatie?

  Een fluorescentietechniek waarbij gebruik wordt gemaakt van twee lichtbronnen. 1 lichtbron activeert de de fluorescente labels, de tweede lichtbron slaat de labels aan.
  

  • activatiesignaal bij golflengte = 413 nm
  • excitatiesignaal bij golflengte = 488 nm

  
  Na het aanslaan kunnen gelabelde moleculen diffunderen, dit volg je over verloop van tijd (met confocale fluorescentie microscopie).

• Hoe kan GFP fungeren als reporten van gen/promotor-activiteit? (2 opties)

  • GFP fuseert met eiwit: fusie-eiwit fluorescent gelabeld
    
  • onder controle van endogene promotor (= de promotor die het onderzochte eiwit aanmaakt): knip de coderende sequenties uit DNA maar laat regelsequenties (zoals promotor) zitten. Plak dan een gen dat codeert voor een fluorescent eiwit erachter. 
  • exogene promotor = promotor uit een ander organisme (wordt nog maar weinig gebruikt)

• Welke informatie kun je achterhalen dmv GFP als reporter voor gen/promotor-activiteit?

  • Locatie van gen activiteit
  • niveau van genexpressie

• Welke kwantitatieve informatie kun je met FRAP & FLIP achterhalen?

  • Diffusiesnelheden
    
  • Bindingsaffiniteit (hoe snel eiwit loslaten/binden ergens aan)
  • Eiwitconcentratie (door intensiteit van signaal)
  • Volume (en vorm)

  
  Al deze kwantitatieve informatie kan ook specifiek zijn voor een bepaald eiwit, daarom is het semi-kwantitatieve analyse.

• Waar staat TIRF voor en hoe werkt het?

  Total Internal Reflection microscopy. Deze techniek lost een probleem op van conventionele microscopie, namelijk dat individuele fluorescent gelabelde moleculen niet te onderscheiden zijn door achtergrond van emmissie of scattering.
  
  

  • Licht komt binnen onder een hoek, minimaal groter dan de kritieke hoek, zodat er totale internal reflectie is van het licht. 
    
  • dit resulteert in een 'evanescent wave' die maar 100-200 nm diep komt --> 'evanescent field'

• Welke factoren hebben invloed op diffusie (en kan je onderzoeken met TIRF)?

  
  

  • invloed van het medium (cytoplasma)
  • invloed van (zelf)associatie. Moleculen hebben een bepaalde hydrodynamische straal (stokes-einstein). Door binding straal groter --> lagere diffusiesnelheid
  • invloed van interactie met DNA en andere moleculen. Door binding aan DNA stopt diffusie
  • invloed van specifieke lokalisatie in compartiment (voornamelijk in eukaryoten)
  • invloed van zeefgedrag. Door meer moleculen in medium meer zeefgedrag.

• Wat voor typen diffusie zijn er, en welke type schalingsgedrag hoort daarbij (met formule)?

  • Normal diffusion - normal diffusion 
    
  • confined diffusion - subdiffusion
  • directed motion - superdiffusion (dit is meestal actief transport)

  
  
  MSD = mean square displacement

• 2 KMB college 5

  Dit is een preview. Er zijn 19 andere flashcards beschikbaar voor hoofdstuk 2
  Laat hier meer flashcards zien

• Wat is superresolutie microscopie?

  • Gaat verder dan de fysiek limiet bij optische beeldvorming
    
  • diffractielimiet = de helft van de golflengte van het gebruikte licht (ong 200 nm)
  • alle technieken met een resolutie beter dan 200nm zijn superresolutie technieken (behalve confocale fluorescentie; dat is geen superresolutie)