Startpagina / Samenvattingen / Samenvatting Analyse therapeutische eiwitten / aggregaten-sds-emissiespectrum

Da = 1 g/mol

Q: Wat is de specifieke informatie over HUMAN APOFERRITIN?

Extinctiecoëfficiënt : 7,23 Bestaat uit 2 ketens : 20 kDa en 21 kDa (totaal 41244 Da) Molaire extinctie: 34965 (1 mol/L) Coefficient : 0,85 (bij 1 g/L) Voorbeelden van concentraties: - A = 0,2 → c = 0,276 mg/ml - A = 0,5 → c = 0,691 mg/ml → 0,59 g/L - A = 0,8 → c = 1,1 mg/ml

Q: Wat zijn de basisprincipes van optical density?

Optische dichtheid omvat: - Absorptie - Light scattering Opgenomen licht door farmacons + stoffen die zorgen voor lichtverstrooiing.

Q: Wat gebeurt er met lichtverstrooiing als de golflengte toeneemt?

Bij een toename van de golflengte neemt de lichtverstrooiing af, en dit komt door: Minder signaalsterkte. Minder interactie met deeltjes in een middel. Bij zichtbaar licht (400-800 nm) is de verstrooiing minder. Het zichtbare licht ligt tussen ultraviolet en infrarood. Meer kleuren duiden op een hoger eiwitgehalte , zichtbaar met UV-Vis.

34 belangrijke vragen over Da = 1 g/mol

Wat is de specifieke informatie over HUMAN APOFERRITIN?

Extinctiecoëfficiënt: 7,23
Bestaat uit 2 ketens: 20 kDa en 21 kDa (totaal 41244 Da)
Molaire extinctie: 34965 (1 mol/L)
Coefficient: 0,85 (bij 1 g/L)
Voorbeelden van concentraties:
- A = 0,2 → c = 0,276 mg/ml
- A = 0,5 → c = 0,691 mg/ml → 0,59 g/L
- A = 0,8 → c = 1,1 mg/ml

Wat zijn de basisprincipes van optical density?

Optische dichtheid omvat:
- Absorptie
- Light scattering
Opgenomen licht door farmacons + stoffen die zorgen voor lichtverstrooiing.

Hoe beïnvloedt de hydrodynamische diameter van eiwitten en verstrooiing de meting van het absorptiespectrum?

Eiwitten met een grotere hydrodynamische diameter veroorzaken meer lichtverstrooiing, wat het absorptiespectrum verhoogt. Belangrijke punten:

Colloïdale systemen zoals liposomen en eiwitaggregaten dragen bij aan verstrooiing.
Verstoorde monsters leiden tot overschatting van de eiwitconcentratie.
Verstrooiing beïnvloedt hele spectrum, sterker bij lagere golflengten.
Aggregatie van eiwitten maakt voorspelling moeilijk.

Wat gebeurt er met lichtverstrooiing als de golflengte toeneemt?

Bij een toename van de golflengte neemt de lichtverstrooiing af, en dit komt door:

Minder signaalsterkte.
Minder interactie met deeltjes in een middel.
Bij zichtbaar licht (400-800 nm) is de verstrooiing minder.
Het zichtbare licht ligt tussen ultraviolet en infrarood.
Meer kleuren duiden op een hoger eiwitgehalte, zichtbaar met UV-Vis.

Hoe wordt vertekening gemeten en welke methoden worden gebruikt voor eiwitconcentratiebepaling?

Eiwitten worden gemeten op meerdere manieren om aggregatie te voorkomen:

Verstrooiing gemeten buiten absorptie, lagere golflengte dan 340 nm.
Chemische methoden:
- Lowry
- Bradford
- BCA: Eiwit + Cu²⁺ → complex via biuret reactie. Kleurintensiteit bij 562 nm.
- ELISA: Antigeen-antilichaam interactie, kleuring door enzymkoppeling.
Analytische technieken:
- HPLC-UV/MS
- CE
- SEC-HPLC: Specifiek, vermijdt verstoring door aminozuren/hulpstoffen.

Wat is het doel van het scheiden op basis van grootte in een bufferoplossing?

Het doel van scheiding op basis van grootte in een bufferoplossing is om de aanwezigheid van verschillende structuren te evalueren. Dit omvat:

Detectie van aggregaten, di- of trimeren.
Handhaven van een natieve conformatie van eiwitten.
Identificatie van degradatieproducten.

Wat is het effect van deeltjesgrootte in een kolom gevuld met bolletjes?

Grote deeltjes leggen een korte weg af omdat ze niet door poriën kunnen.
Kleine deeltjes bewegen verder doordat ze door poriën kunnen dringen.
Aggregaten kunnen kolom verstopping veroorzaken.
Voorkolom wordt gebruikt om aggregaten te verwijderen.
Resultaten richten zich meer op productkwaliteit dan op kwantificering.

Hoe beïnvloedt het gebruik van SDS of GuHCl de scheidingsrange in SEC?

Scheidingsrange is smaller met SDS of GuHCl.
SDS zorgt voor negatieve lading rondom deeltjes.
GuHCl ontvouwt eiwitten, vaak gecombineerd met SDS.
Scheiding moeilijker bij grote eiwitten door grotere diameter.
GuHCl sterker denaturerend dan SDS.

Wat zijn de vereisten voor de pH-waarde van de oplossing voor SEC?

pH moet tussen 2,5 en 7,5 liggen.
Silica in de kolom is niet bestand tegen pH buiten deze range.
Silica oplosbaar bij onjuiste pH-waarden.

Hoe kunnen grote deeltjes in SEC verstopping van de kolom voorkomen?

Voorkolom kan grootste aggregaten uitvissen.
Monster kan worden gecentrifugeerd voor plaatsing in kolom.
Centrifugeren kan eiwit stress veroorzaken door schuimvorming.
Aggregaten ontvouwen vermijden voor juiste waarneming.

Hoe interpreteer je resultaten bij SEC met betrekking tot molecuulgewicht en kwaliteit?

Kwaliteit van het product is belangrijker dan kwantitatieve meting.
Molecuulgewicht wordt meestal gecombineerd met HPLC-analyses.
Grafiekpieken kunnen hoog lijken door deeltjes buiten de scheidingsrange.

Waarom is massaspectometrie geschikter dan SEC voor identificatie?

Voor identificatie van deeltjes wordt massaspectometrie beschouwd als geschikter dan SEC door:

SEC kijkt naar diameter, wat voor veel deeltjes identiek kan zijn.
Massaspectometrie biedt gedetailleerdere identificatie door massa/ladingsverhouding.
SEC toont absorptie- en molecuulgewichtverdeling, maar minder geschikt voor unieke identificatie.
Aggregaten komen voor in therapeutische eiwitproducten, met specifieke toleranties per eiwit.
Grafiek toont molecuulgewicht: hoog, intermediair en laag.

Wat zijn de pieken voor het eiwit in een analyse?

De pieken voor het eiwit zijn:

AGGREGAAT
DI- OF TRIMEREN

Wat vertegenwoordigen de pieken na het eiwit?

Na de piek van het eiwit zijn er:

AFBRAAKPRODUCTEN VAN EIWIT
Deze producten zijn minder problematisch dan aggregaten.

Waarom zijn afbraakproducten minder problematisch dan aggregaten?

Afbraakproducten zijn minder problematisch omdat ze:

Minder immunogeen zijn
Aggregaten hebben verschillende immunogeniciteit

Hoe verhouden di- en trimeren zich tot aggregaten?

Di- en trimeren zijn vaa

Hoe werkt SDS-PAGE en wat is het doel van deze techniek?

SDS-PAGE scheidt eiwitten op basis van grootte:

Denaturatie: Eiwitten worden ontvouwen en negatief geladen door SDS en DTT.
Electroforese: Polyacrylamidegel scheidt eiwitten; grote eiwitten bewegen trager.
Eindresultaat: Analyses zoals het identificeren van aggregaten en degradatieproducten mogelijk.

Wat is de rol van log(kDa) ten opzichte van retentietijd in een SDS-PAGE-experiment?

Log(kDa) en retentietijd helpen bij:

Standaardcurve: Bepalen moleculaire massa van onbekende eiwitten.
Vergelijking: Retentietijd vergelijken met referentie-eiwitten voor identificatie.
Analyse: Kwaliteitscontrole zoals vervorming of zuiverheid van eiwitten.

Wat gebeurt er bij immunoglobulines tijdens het gebruik van SDS?

Bij gebruik van SDS wordt het eiwit als volgt beïnvloed:

Denaturatie van eiwit;
Verbreking van zwavelbruggen;
Heavy en light chains komen los van elkaar.

Bij meer dan 2 lijnen kunnen aggregaten of degradatieproducten aanwezig zijn.

Wat is de functie van native-PAGE in eiwitanalyse?

Deze techniek kan het volgende:

Eiwit wordt niet gedenatureerd;
Complexen worden gescheiden op basis van lading en gewicht.

Resultaten helpen bij het identificeren van aggregaten, di- of trimeren en degradatieproducten. Meerdere bandjes kunnen duiden op isovormen.

Wat is de verwachting bij het analyseren van immunoglobulines met SDS?

Bij het analyseren zijn de volgende punten belangrij

Hoe werkt de techniek van NATIVE-PAGE en wat zijn de interpretaties van de resultaten?

De NATIVE-PAGE techniek heeft de volgende kenmerken:

Eiwitten worden niet gedenatureerd.
Complexen worden gescheiden op basis van lading en gewicht.
Resultaten worden geïmpliceerd door:

Separatie op grootte om aggregaten en di- of trimeren te identificeren.
- Geen SDS-DTT gebruik, waardoor slechts één lijn verwacht wordt.
- Meerdere bandjes kunnen wijzen op aggregaten of degradatieproducten.

4. Isovormen kunnen ook ontstaan door verschillende glycosylering.

Wat zijn de twee vormen van fluorescentie en hoe werkt de techniek?

Fluorescentie kent de volgende vormen:
1. INTRINSIEK:
- Gebaseerd op tryptofaan (295 nm), tyrosine, fenylanaline.
2. EXTRINSIEK:
- Inclusief fluorescent dye.
3. Werking:

Golflengte wordt naar het eiwit gestuurd.
- Tryptofaan absorbeert licht (foton) en exciteerd elektronen.
- Energie wordt uitgestraald via warmte of fluorescentie = emmissie.
- Overgang absorptie naar emissie met andere golflengte = stokes shift.

Wat zijn de belangrijkste aspecten bij het vergelijken van NATIVE-PAGE met SDS-PAGE?

De vergelijking van NATIVE-PAGE met SDS-PAGE omvat deze punten:

NATIVE-PAGE toont niet-gedenatureerde eiwitten.
SDS-PAGE introduceert denaturatie van eiwitten.
Bij NATIVE-PAGE kun je verschillende isovormen zien.
Beide technieken helpen vaststellen of een monster vervormd is of niet.
NATIVE-PAGE geeft een beter beeld van complexen.

Wat betekent een verschuiving in het absorptie- en emissiespectrum?

Een verschuiving naar rechts in het absorptie- en emissiespectrum betekent een toename in golflengte. Dit fenomeen is belangrijk voor:

Analyseren van eiwitvouwing door emissiemeting.
Het gebruik van Stokes verschuiving tussen absorptie en emissie.
Vaak gecombineerd met andere technieken voor volledige analysekracht omdat directe gehaltebepaling niet mogelijk is.

Waarom kan een emissiespectrum alleen worden gemeten bij grotere golflengtes dan een absorptiespectrum?

Emissie heeft betrekking op het meten van fotonen met lage energie:

Deze fotonen hebben een grotere golflengte dan die van absorptie.
Eiwitten moeten een fluofoor bevatten, zoals tryptofaan, met een dipoolmoment en aromatische structuur.
Excitatie leidt tot verandering in richting van het dipoolmoment.
Watermoleculen moeten ook van richting veranderen, wat energie kost.

Hoe beïnvloedt solvent relaxation de energie van een geëxciteerd fluofoor?

Solvent relaxation betreft de heroriëntatie van oplosmiddelmoleculen:

Excitatie verandert het dipoolmoment van het fluofoor.
Water, met een dipoolmoment, moet zich heroriënteren.
Deze heroriëntatie kost energie en maakt de toestand energetisch gunstiger.
Het fluofoor zendt een golflengte uit met minder energie.

Wat gebeurt er met de Stokes Shift als het oplosmiddel polairder wordt?

De energieverlies door oplosmiddel relaxation neemt toe bij een polairder oplosmiddel, wat leidt tot een grotere Stokes Shift. Dit effect komt voort uit:

Toename van de interacties tussen de opgeloste stof en het oplosmiddel.
Veranderingen in de energetische toestand van de moleculen.

Wat is de betekenis van tryptofaan binnen eiwitten en de gevolgen van ontvouwen?

Dit aminozuur is normaal gesproken hydrofoob en bevindt zich binnenin eiwitten. Bij ontvouwen:

Meer tryptofaan aan de buitenkant
Meer wateromringing
Verhoogd energieverlies
Hogere golflengte

Hoe kun je het emissiespectrum van een eiwit interpreteren?

Evaluatie van het emissiespectrum geeft inzicht in eiwitvouwing:

Emissiemaximum en stokes shift: afh. van solventpolariteit
Totale intensiteit: aanwijzing voor quenching moleculen
Noodzaak tot buffermetingen: buffer kan de resultaten beïnvloeden
Eerste piek doorgaans verandering door scattering

Hoe interpreteer je de resultaten van de enzymactiviteit?

Resultaten wijzen op enzymactiviteit:

Bepaalde kleur geeft activiteit aan
Activiteit gerelateerd aan eiwitouwing
Slechte vouw resulteert in geringere activiteit
Specifieke activiteit belangrij

Wat kenmerkt een gevalideerde assay?

Een gevalideerde assay wordt gekenmerkt door:

Nauwkeurigheid: Het vermogen om dicht bij de ware waarde te meten.
Precisie: Consistentie in meetresultaten bij herhaling.
Selectiviteit: Vermogen om specifiek de gewenste componenten te meten zonder interferentie van andere stoffen.

Hoe werkt Dynamic Light Scattering (DLS) voor het meten van eiwitstabiliteit?

Dynamic Light Scattering werkt als volgt:

Maakt gebruik van een laser en detector om de grootte van deeltjes te meten.
Meetberei

Welke resultaten kunnen worden verkregen met Dynamic Light Scattering (DLS)?

Resultaten van DLS omvatten:

Zave (nm): Gemeten grootte; grotere waarden wijzen op aggregaten.
Count rate: Combinatie van grootte en hoeveelheid; hogere waarden bij meer en grotere deeltjes.
Pdi (polydispersiteit): Kleiner is beter; lage waarden worden vaak overschaduwd door aggregaten.

De vragen op deze pagina komen uit de samenvatting van het volgende studiemateriaal:

Samenvatting Analyse therapeutische eiwitten

Bekijk samenvatting

Een unieke studie- en oefentool
Nooit meer iets twee keer studeren
Haal de cijfers waar je op hoopt
100% zeker alles onthouden

Onthoud sneller, leer beter. Wetenschappelijk bewezen.

Studiemateriaal generieke omslagafbeelding